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細(xì)胞污染的類型
一、細(xì)菌污染
細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染。 一開始就要十分重視，防止污染，否則會(huì)前功盡棄，不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚至造成無法彌補(bǔ)的損失。即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。zui常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。
培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變而呈現(xiàn)黃色。也有的 培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，zui后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。一般細(xì)菌污染進(jìn)程很快，大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到。
二、真菌污染
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。zui常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間（發(fā)生卵圓形物體污染的幾率很大）。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但zui后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。
三、支原體污染
支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的zui小微生物，zui小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。
培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。
四、病毒污染
采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
五、非同種細(xì)胞污染
由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。
非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。
污染來源及鑒別
一、污染來源
細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染的來源主要有以下幾條途徑：
1、不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本
很多動(dòng)物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外)，但由于取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì)。組織本身含有細(xì)菌，如取材時(shí)不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會(huì)帶菌，造成細(xì)胞污染。
2、空氣
空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺(tái)使用過久，濾板未定期更換或長(zhǎng)久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過強(qiáng)，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會(huì)導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不*也會(huì)引入微生物和有毒物質(zhì)。
4、操作
來自操作者的污染主要有以下幾方面：
1、器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過，或者雖經(jīng)處理，時(shí)隔已久又末重新處理。
2、操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細(xì)菌和支原體。
3、培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。
4、操作者不當(dāng)心，動(dòng)作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。
5、細(xì)胞傾液時(shí)倒出培養(yǎng)瓶或者滴落在超凈臺(tái)上，未及時(shí)擦凈或者灼燒。 6、灼燒的火不夠旺。
7、移液管吸取液體時(shí)將空氣中的氣流吸入培養(yǎng)瓶中。
8、長(zhǎng)時(shí)間的將離心管放在離心機(jī)中，可能由于口沒有*封閉而造成污染。
9、同一根吸管或者放置吸管的離心管長(zhǎng)時(shí)間使用造成的一管污染多瓶細(xì)胞交叉污染。
10、操作者操作時(shí)大聲說話，來回走動(dòng)揚(yáng)起灰塵等。
5、血清，市售血清滅菌不*，潛在病毒和支原體污染。
二、污染的鑒別
1、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)
（1）肉眼觀察 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。
（2）鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。
（3）接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 2、支原體污染的檢測(cè) （1）相差顯微鏡觀察 將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的支持物(一般用長(zhǎng)形蓋玻片)，24小時(shí)后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。
（2）熒光染色法觀察 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前（即未長(zhǎng)滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI或者PI等核染色試劑，染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 （4）電鏡檢測(cè) 可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法。
（5）培養(yǎng)檢測(cè) 將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可），培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。
培養(yǎng)加熒光核染色是檢測(cè)支原體污染的黃金搭檔。
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