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Part I：天然抗體庫構(gòu)建、免疫抗體庫構(gòu)建、多種片段抗體庫構(gòu)建、抗體人源化
1、技術(shù)路線
外周血淋巴細(xì)胞/脾細(xì)胞?提取RNA/gDNA?PCR出全套抗體片段（Fab、scFv等）?隨機(jī)重組插入噬菌體外殼蛋白?感染大腸桿菌?抗體片段展示于噬菌體表面?抗原特異性篩選?富集有效結(jié)合克隆?擴(kuò)增結(jié)合力強(qiáng)的克隆。
2、技術(shù)應(yīng)用（主要在醫(yī)學(xué)口）
（1）在寄生蟲醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（如瘧原蟲、吸血蟲等），進(jìn)行診斷試劑與疫苗的開發(fā)，例如分子疫苗制備、保護(hù)性抗原制備。
篩選抗靶蛋白抗體可變區(qū)---研究蛋白分子免疫識(shí)別---篩選診斷試劑/篩選新型疫苗 例子：篩選抗寄生蟲抗原的鼠源抗體scFv可變區(qū)片段，進(jìn)一步研究抗原結(jié)構(gòu)和功能，后續(xù)可以制備治療用和診斷用的抗體。
優(yōu)勢：人源化的抗體/抗體片段可通過工程菌進(jìn)行大量生產(chǎn)，降低成本。
（2）在醫(yī)學(xué)微生物中的應(yīng)用（已獲得針對(duì)HAV、HBV、HCV、HIV、VZV、RSV、風(fēng)疹病毒、CMV、流感嗜血桿菌和破傷風(fēng)毒素、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒糖蛋白、TNF-alpha等的單抗） 作為診斷試劑、治療藥物的開發(fā)工具。
成功案例：對(duì)病毒性肝炎診治，對(duì)肝炎臨床診斷、基因治療、發(fā)病機(jī)制研究研究提供工具 （3）細(xì)胞內(nèi)免疫：針對(duì)病毒或腫瘤抗原表達(dá)
例子：將篩庫得到的高親和力抗體的scFv基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞，通過表達(dá)的抗體與靶抗原結(jié)合阻止病毒生成、干擾腫瘤細(xì)胞的代謝。 （4）血液心血管系統(tǒng)研究
例子：血栓類心血管疾病研究：血栓形成導(dǎo)致多種心血管疾病，使用噬菌體篩庫得到的抗人纖維蛋白單鏈抗體可用于血栓性疾病的定位診斷、導(dǎo)向性溶栓治療。優(yōu)勢：單鏈抗體分子量?。贵w的zui小活性單位）、組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、集中針對(duì)目標(biāo)組織。 例子1：血液類：EPO為治療貧血多肽藥物，篩庫得抗EPO單鏈抗體，用于獲得重組buEPO及研發(fā)EPO檢測試劑盒。
例子2：血液類：構(gòu)建50AMcAb單鏈?zhǔn)删w抗體庫，研發(fā)原核表達(dá)的血型鑒定抗體試劑；構(gòu)建抗人紅細(xì)胞單鏈抗體scFv，與ABO血型無關(guān)，用于快速血凝診斷 （5）自身免疫疾病研究（重癥肌無力、Grave’s病、喬本氏甲狀腺炎等） 研究人體自身抗體1
的分布、基因構(gòu)建、遺傳規(guī)律、產(chǎn)生機(jī)制及自身抗原2的性質(zhì)
自身抗體是指針對(duì)自身組織，器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體。正常人體血液中可以有低滴度的自身抗體，如果自身抗體的滴度超過某一水平，就可能對(duì)身體產(chǎn)生損傷，誘發(fā)疾病。優(yōu)勢：容易操作，可大量制備，抗體人源化。已發(fā)現(xiàn)的64株IgG類自身抗體中有49株是噬菌體抗體庫技術(shù)得到的
其他自身免疫疾病研究：干燥綜合征、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、魏格納氏肉芽腫
（6）腫瘤研究及藥物靶向治療
利用腫瘤相關(guān)抗原TAA或腫瘤特異性抗原TSA從噬菌體抗體庫中篩選，得到的單鏈可變區(qū)抗體分子量小，組織滲透性強(qiáng)，可用于體內(nèi)造影診斷、免疫治療抗體藥物開發(fā)。 優(yōu)勢：噬菌體抗體庫篩選的TAA TSA抗體具有親和力強(qiáng)、特異性高的特點(diǎn)，可用于靶向治療 例子：從HBx（肝癌相關(guān)抗原）單抗細(xì)胞中克隆重鏈可變區(qū)基因，重組入M13噬菌體，驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物具有活性，然后表達(dá)出單鏈抗體、單域抗體或嵌合抗體，為肝癌導(dǎo)向治療研究提供基礎(chǔ)。
（7）弱免疫原性物質(zhì)的特異性抗體制備：
制備一些很難獲得的抗體，如特異性識(shí)別MHC I類分子-抗原肽復(fù)合物的抗體、胸腺上皮抗體、雌激素抗體等。 （8）食品安全、環(huán)境安全檢測
例子1：以致癌物質(zhì)黃曲霉素偶聯(lián)物免疫小鼠，制備小鼠源性抗黃曲霉素單鏈抗體ScFV庫，篩選高親和力抗體，可用于對(duì)花生等進(jìn)行食品安全檢測
例子2：以除蟲菊酯偶聯(lián)物免疫小鼠，構(gòu)建噬菌體抗體文庫并篩選抗除蟲菊酯的高親和力抗體，對(duì)監(jiān)測環(huán)境中農(nóng)藥殘留、提高種植業(yè)科學(xué)用藥具有重要意義 總結(jié)：
噬菌體抗體庫構(gòu)建這塊，大多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)相關(guān)研究，客戶主要集中于醫(yī)院中設(shè)立的研發(fā)機(jī)構(gòu)，且大多涉及到人源化改造，其次也有些科研用戶，比如高?；蜓芯克尼t(yī)學(xué)生物相關(guān)專業(yè)，研究與疫病、自身免疫等相關(guān)科室，會(huì)用到動(dòng)物自身抗體來做研發(fā)，另外還有一類，也是目前我們準(zhǔn)備研發(fā)的項(xiàng)目，前景較大，跟組學(xué)相關(guān)聯(lián)，客戶在組學(xué)這塊做完差異蛋白鑒定之后，在眾多差異蛋白中無法確定優(yōu)先做哪些蛋白，但是又想進(jìn)一步研究蛋白表達(dá)差異時(shí)，需要制備較多抗體，可借用我們構(gòu)建的鼠抗體庫或者兔抗體庫，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模蛋白的抗體篩選，可zui大程度的降低成本和周期。
Part 2： 噬菌體隨機(jī)多肽庫
1、技術(shù)路線
多肽序列設(shè)計(jì)? DNA序列?插入噬菌體外殼蛋白?感染大腸桿菌?抗體片段展示于噬菌體表面?抗原特異性篩選?富集有效結(jié)合克隆?擴(kuò)增結(jié)合力強(qiáng)的克隆。
2、技術(shù)應(yīng)用
（1）蛋白相互作用
能誘導(dǎo)宿主發(fā)生自身應(yīng)答的物質(zhì)稱為自身抗原。正常情況下免疫系統(tǒng)對(duì)自身物質(zhì)不作為抗原來對(duì)待，但當(dāng)機(jī)體受到外傷或感染等刺激時(shí)，就會(huì)使隱蔽的自身抗原暴露或改變自身的抗原結(jié)構(gòu)，或者免疫系統(tǒng)本身發(fā)生異常，這些情況均可使免疫系統(tǒng)將自身物質(zhì)當(dāng)作抗原性異物來識(shí)別，誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，引起自身免疫病。
研究互作蛋白間氨基酸殘基的特征，為蛋白質(zhì)相互作用和功能基因組學(xué)的研究提供工具。例如對(duì)功能蛋白的“熱點(diǎn)”-蛋白互作的zui小功能域-進(jìn)行鑒定，鑒定重要生物大分子如生長激素受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）受體的激動(dòng)劑和拮抗劑，這類多肽定義為熱點(diǎn)配體HSPL。
例子1：Pillulta用高度多樣性的隨機(jī)肽庫噬菌體文庫進(jìn)行篩選，分離出10個(gè)能競爭性結(jié)合胰島素受體的多肽，并且與胰島素?zé)o序列同源性，通過競爭鑒定實(shí)驗(yàn)確定了這些多肽在胰島素分子上的結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)激活的酶活性類型和激動(dòng)劑、拮抗劑功效。
例子2：TNF-α和TNF-β具有防御感染的左右，其生物學(xué)效應(yīng)由膜受體TNFR1(p55)和TNFR2(p75)來介導(dǎo)，用TNFR2(p75)篩選肽庫分離到了4個(gè)與TNFR2特異性結(jié)合HSPL肽，其中有3個(gè)能誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)。
（2）腫瘤相關(guān)抗原研究
鑒定分析腫瘤細(xì)胞或腫瘤血管內(nèi)皮表達(dá)的特異性癌細(xì)胞抗原的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)腫瘤的早期診斷和靶向治療有重要意義。例如篩選腫瘤相關(guān)抗原、尋找具有治療作用的靶肽等。 例子1：用胃癌單抗MG7-Ab對(duì)隨機(jī)肽庫進(jìn)行篩選，得到相對(duì)保守的表位信息，為研究單抗與胃癌相關(guān)抗原MG7-Ag的結(jié)合的結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)
例子2：抗腫瘤單抗分子量大，組織滲透力差且易被肝、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)非特異性吸收，肽類藥物可以克服這些缺點(diǎn)。用人B細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞系SUP-88表面*性進(jìn)行篩庫，得到一系列現(xiàn)行肽基元，其中一些短肽以二聚體或四聚體形式呈遞給完整細(xì)胞時(shí)能激發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
例子3：用前列腺癌特意性抗原PSA篩選肽庫鑒定到的配體肽與PSA的結(jié)合受鋅離子影響，有發(fā)展為治療制劑的潛力。
（3）疫苗研制
噬菌體肽庫能篩選到一些抗原的模擬表位，這些模擬抗原還具有一定的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體能與真正的病原體上的天然表位反應(yīng)，這有利于將發(fā)現(xiàn)的表位作為人工合成疫苗的一個(gè)組分，在疫苗設(shè)計(jì)方面有廣泛的應(yīng)用前景。
例子：為解決非典型嗜血流感桿菌毒力因子表面蛋白混合寡糖LOS制備疫苗遇到的免疫原型弱的問題，用兔抗LOS篩選肽庫，得到4個(gè)一致性序列，其中3個(gè)與兔抗親和力高。用篩選得到的3個(gè)高親和力肽免疫兔得到的抗體對(duì)染病小鼠模型具有抗體保護(hù)性作用。 總結(jié)：
噬菌體隨機(jī)肽庫，zui主要的應(yīng)用，就是研究互作，不管是天然組織、細(xì)胞或者蛋白，還是重組的蛋白及合成的多肽，想了解與其互作的克隆序列，進(jìn)而結(jié)合物種內(nèi)蛋白序列進(jìn)行分析，確認(rèn)可能互作的蛋白信息，其次就是獲取抗原表位序列，抗原決定簇一般由5-12個(gè)aa組成，通過抗體對(duì)多肽庫的篩選，獲得對(duì)應(yīng)表位的序列，為疫苗研發(fā)等工作提供依據(jù)
Part 3雙特異性抗體BsAb
1、技術(shù)應(yīng)用
（1）導(dǎo)向免疫治療
雙特異性抗體主要應(yīng)用于腫瘤的治療中，它一方面能夠結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的激活分子（能激活效應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞）或偶聯(lián)毒素，另一方面結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原TAA，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
例子1：用長春花堿的BsAb注射入荷瘤小鼠，腫瘤的生長受到明顯抑制
例子2：在體外實(shí)驗(yàn)中，用抗CD3-抗HIV的BsAb武裝的T淋巴細(xì)胞能對(duì)HIV感染的靶細(xì)胞產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒效應(yīng)，且不受HIV的制約，所以健康人的T細(xì)胞有望用于HIV患者的治療。 例子3：用抗CD3-抗腫瘤的BsAb與淋巴因子激活的殺傷LAK細(xì)胞結(jié)合起來治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，兩年存活率相比于只是用LAK細(xì)胞的一組明顯升高。
（2）免疫學(xué)診斷
抗靶抗原-抗標(biāo)記酶的BsAb能用一步法簡化檢測流程，在免疫檢測方面有優(yōu)勢
例子1：免疫組織學(xué)標(biāo)記過程中，使用BsAb與標(biāo)記酶分步加樣，因?yàn)锽sAb分子量小，組織穿透力強(qiáng)，故能提高檢測靈敏度
例子2：魏巍制備的針對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌的BsAb具有良好特異性，對(duì)正常膀胱粘膜組織和腺癌組織切片均未顯色。
例子3：抗HCG和抗脲酶的BsAb在夾心ELISA中HCGzui低檢出限為25U/L，與相應(yīng)的酶抗體檢測結(jié)果相當(dāng)，此抗體與酶結(jié)合物在4 ℃穩(wěn)定性達(dá)數(shù)月之久。將抗體與某些酶基因相連，表達(dá)出的酶標(biāo)抗體可直接用于檢測和示蹤研究
在影像學(xué)診斷方面，BsAb能有效提高放射性標(biāo)記物對(duì)病變部位的趨向性，減少對(duì)正常組織的損害。
例子4：用放射性碘標(biāo)記的抗CEA片段分別與單價(jià)scFv、scFv二聚體、scFv-CH3微型抗體結(jié)合，對(duì)LS174T荷瘤無胸腺小鼠進(jìn)行腫瘤靶向和生物分布研究，scFv-CH3微型抗體的藥代動(dòng)力學(xué)和清除特性適中，適合定位顯影。
例子5：將CEA/HSG BsAb聯(lián)合PET和SPECT應(yīng)用于肺內(nèi)微轉(zhuǎn)移的人結(jié)腸癌裸鼠分子顯影中，該CEA/HSG BsAb具有高度靶向定位特性。
（3）免疫性疾病治療中的應(yīng)用 過敏性疾病中的應(yīng)用：
例子1：Tam發(fā)現(xiàn)IgE/Fcy II BsAb不會(huì)引發(fā)IgE致敏細(xì)胞中組胺的釋放，它能阻止引發(fā)組胺釋放的特定抗原的觸發(fā)，同時(shí)抑制肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的活化，能應(yīng)用于過敏性疾病的治療。
例子2：Lum發(fā)現(xiàn)CD3/CMV BsAb能夠靶向T細(xì)胞，可以用來預(yù)防和治療造血干細(xì)胞移植后的巨細(xì)胞病毒感染。
總結(jié)：
雙特異性抗體，主要應(yīng)用方向也是在靶向治療上面，雙特異性，顧名思義有2個(gè)抗體靶向，一個(gè)用于定位，一個(gè)用于消除，真正做診斷靶向級(jí)別的客戶，一般不會(huì)選擇定制，如果只是研發(fā)方向，為寫文章，這個(gè)都是可以做的，所以客戶群體相對(duì)分散，有意向咨詢可再做詳細(xì)跟進(jìn)。
Part 4 參考文獻(xiàn)
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