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一、PCR產(chǎn)物的T載體克隆
（一）重組T質(zhì)粒的構(gòu)建
一．原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。
DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；zui后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA pian斷有兩個端點，所以切割時出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對載體進(jìn)行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA pian斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會自環(huán)。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5’端就能與載體進(jìn)行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可zui大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。
二．材料與方法
1 材料
外源DNA pian斷
2 儀器、用具 移液槍、碎冰
3 試劑
pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP
4 方法
連接體系如下：16℃連接過夜。
（二）重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定
1 材料
E.coli JM109菌株
2 儀器、用具
超凈工作臺、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器
3 試劑
(1) CaCl2、LB平板（見附錄）；SOC培養(yǎng)基（見附錄）；SOB培養(yǎng)基
(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無水乙醇的Buffer W2a (3) 1×電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心]；瓊脂糖；6×加樣緩沖液 (4) 酚；氯fang
；異戊醇
(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶
4 方法
1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
(1) 取大腸桿菌JM109保存液50μl，接種于4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37℃，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜，第二天取50μl 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3h至OD600=0.35～0.4，在無菌操作臺上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。
(2) 4℃，5000rpm離心2min，去上清液。
(3) 加入750μl預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰浴30min。 (4) 4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。
(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
2. 重組DNA的轉(zhuǎn)化
(1) 將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預(yù)熱。
(2) 于100μl感受態(tài)細(xì)胞中加入10μl連接產(chǎn)物，冰浴30min。
(3) 將離心管轉(zhuǎn)入42℃水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2min。
(4) 在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300μl，槍頭混勻，37℃、150rpm溫和搖振60min。
(5) 將200μl 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。
注意事項：
① 制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。
② 42℃熱處理時很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。
③ 菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因為感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。
3． 重組質(zhì)粒的鑒定
方案一 菌落PCR
(1) 制備PCR混合液：
(2) 用經(jīng)滅菌的10μl槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中3) 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。
(4) 將步驟 ⑶ 的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。 (5) 按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條 件為：94℃變性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。 (6) 取5μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。
方案二 質(zhì)粒PCR
1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA
(1) 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。
(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。
(3) 加入250μl Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過5min。 *Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。
(4) 加入400μl Buffer S3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。 *若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。
(5) 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm離心1min。
(6) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm離心1min。
(7) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700μl已加無水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的Buffer W2洗滌一次。
(8) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。 (9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 離心管中，在silica 膜 中央加入25-30μl Eluent或去離子水。
(10) 室溫靜置2 min，14000rpm離心1min洗脫DNA。
(11) 取5μL樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉(zhuǎn)化子。
2. 抽提純化質(zhì)粒DNA酚、氯fang抽提可以去除堿裂解法制備的質(zhì)粒DNA中殘留的蛋白質(zhì)。
(1) 加TE稀釋質(zhì)粒DNA溶液至300μL。
(2) 加等體積的酚:氯fang:異戊醇（25:24:1），震蕩混勻，靜置3min。
(3) 14000rpm 離心5min，吸上清液，加等體積的酚:氯fang:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3min。 (4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯fang:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。
(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，加2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后-20℃放置15min，沉淀質(zhì)粒DNA。
(6) 14000rpm離心13min，棄上清液，沉淀加入200μL 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20μL去離子雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA沉淀，-20℃保存待用。 (7) 取5μl樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結(jié)果。
3. 質(zhì)粒PCR
(1) PCR反應(yīng)體系如下：(2) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；然后進(jìn)行30 個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為： 94℃變性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。 (3) 取5μl PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，方法與試驗二相同。
二、PCR產(chǎn)物的克隆
PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。
平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提率。
粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和PCR產(chǎn)物上產(chǎn)生長的可互補(bǔ)的粘性末端。zui普遍的方法是在引物的5’端加入一段某種限制酶的識別序列。如果兩個引物選用不同的限制性內(nèi)切酶識別序列，就可以做到定向連接。另一類利用部分PCR產(chǎn)物3’端帶有一個凸出的dAMP的特性，構(gòu)建3’端帶有凸出的dTMP的載體。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70℃或72℃下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應(yīng)體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時（也有人報道處理1～2小時能提高克隆效率，這樣加T反應(yīng)會更*）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來完成加T反應(yīng)。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddTTP，效果會更好。這種方法一般稱為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50～100倍。
（一）、PCR產(chǎn)物的TA克隆
1. TA克隆構(gòu)建原理：TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（MCS）中。
2.操作步驟
⑴ 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
⑵ 10μl體積反應(yīng)體系如下：
①取T載體1μl (50ng)，加入等摩爾數(shù)PCR產(chǎn)物 。
②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位，用ddH2O 補(bǔ)足至10μl 。
⑶ 稍加離心，通常為14-16℃水浴連接8-14hr，或4℃過夜。 ⑷ 轉(zhuǎn)染，藍(lán)白斑篩選同前。
（二）、注意事項
1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。 2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過純化。
3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過程中防止外來DNA污染。
PCR產(chǎn)物的TA克隆
通過PCR的方法擴(kuò)增目的基因片斷的過程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片斷通常需要通過TA克隆的方法，重組到T-載體中，通過序列測定清楚DNA序列。由于在PCR過程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分為2種情況：
（1）使用不同的Taq酶，在PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，加上72℃10分鐘一個過程，Taq酶可以在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。
（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A，得到的DNA序列為鈍端，因此，需要在回收純化后進(jìn)行加A的過程，通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分鐘，然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。
pMD 18-T Vector是一種克隆PCR產(chǎn)物 (TA Cloning)的載體。它是TaKaRa獨自研究開發(fā)，由pUC18載體改建而成的。在pUC18載體的多克隆位點處的Xba I 和Sal I識別位點之間插入了EcoR V 識別位點，用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。本制品是以zui為常用的pUC18載體為基礎(chǔ)研制而成，所以它具有同pUC18載體*相同的功能。此外，本制品中的連接液Ligation Solution I 可以在極短的時間內(nèi) (30分鐘-1小時)完成連接反應(yīng)，大大地方便了實驗操作。另外，本制品中還含有Control Insert (500 bp)，可用于Control反應(yīng)。 用途：克隆PCR產(chǎn)物。對克隆后的PCR產(chǎn)物用M13 Primers進(jìn)行DNA測序。
α互補(bǔ)和藍(lán)白篩選的原理：許多載體（包括pMD18-T）都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動子和編碼其N端氨基酸（α肽鏈）的片斷基因。宿主具有編碼β半乳糖苷酶的C端基因。當(dāng)二者產(chǎn)物組合在一起，就具有活性酶的產(chǎn)生，此現(xiàn)象稱為α互補(bǔ)。由α互補(bǔ)形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal顯色測定出來，它能將無色的化合物Xgal切割成半乳糖和藍(lán)色底物。當(dāng)外源DNA pian斷插入到多克隆位點后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)的β半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽鏈，而導(dǎo)致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色的，而沒有插入外源片斷的則是藍(lán)色的。
實驗內(nèi)容：
試劑
pMD 18-T Vector試劑盒，或自己PCR擴(kuò)增回收純化的片段，T4DNA鏈接酶。IPTG，X-gal，LB培養(yǎng)基等。
200mg/ml的IPTG 過濾除菌
20mg/ml的X—gal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。
操作步驟
1. 在微型離心管中制備下述連接反應(yīng)液，全量為10 ml。
pMD 18-T Vector 1ml*
control insert DNA 1ml*
H20 3ml
ligation solution I 5ul
l進(jìn)行實驗也可得到滿意的結(jié)果。實際操作時，可按實驗需要使用適量的T載體。m* 取0.5
2. 16℃反應(yīng)30分鐘 (過夜反應(yīng)也不影響連接效率)。 l)中。m
3. 全量 (10ml) 轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞 (100
4. 在含有40ml 20mg/ml的X-Gal、4ml 200mg/ml 的IPTG、50-100mg/ml Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍(lán)色菌落。
5. 挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)T載體中插入片段的長度大小。
注意事項：
1. Ligation Solution I 請于冰中融解。
2. 在進(jìn)行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.15pmol。
3. 克隆時使用的Insert DNA piam 段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會影響TA克隆的效率。
4. 按照本實驗操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時的連接液不要超過20 ml。當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA用量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀，純化DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
5. 連接反應(yīng)請在16℃下進(jìn)行，溫度升高 (>26℃) 較難形成環(huán)狀DNA。
6. 連接效率偏低時，可適當(dāng)延長連接時間至數(shù)小時。
7. 感受態(tài)細(xì)胞可使用適合于pUC系列載體的感受態(tài)細(xì)胞，如：JM109，DH等。
相關(guān)問題
怎樣提高pMD18-T Vector的克隆效率?
1. 純化PCR產(chǎn)物。切膠回收的PCR片段
2. 除去殘存的引物等雜質(zhì)。
3. DNA pian段的立體結(jié)構(gòu)、DNA Pian段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉(zhuǎn)化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，建議采用電轉(zhuǎn)化方法。
PCR產(chǎn)物難以插入載體，為什么?
1. 確認(rèn)PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物不能直接用于TA克?。?/span>PCR產(chǎn)物保存時間不要過長, 長時間保存的PCR產(chǎn)物會脫去末端的"A"堿基。
2. PCR產(chǎn)物中短片段雜質(zhì)DNA太多，這時應(yīng)切膠回收純化DNA pian段，回收時PCR產(chǎn)物不要在紫外線下暴露時間過長。
3. 確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，使用的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/mg pUC118 DNA。
4. 確認(rèn)Ligation Solution I 的連接效率是否降低，多次反復(fù)凍融會降低的Ligation Solution I 連接效率。
5. 確認(rèn)抗生素的濃度是否過大。
6. 使用新配制的平板培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)化后的菌落全為藍(lán)色 (或淡藍(lán)色)，為什么?
插入的PCR片段較短（小于500 bp)，且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時，平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落有可能呈現(xiàn)藍(lán)色。
插入的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序時，可使用何種引物?
本制品的載體來源于pUC18載體。因此，用于pUC18載體測序的引物都可以使用。
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