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實(shí)驗(yàn)材料和方法
從1968年 zui早的商品化 流式細(xì)胞術(shù)(FC) 和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)誕生以來, 它們已得到大大改進(jìn)。但要成為實(shí)驗(yàn)室廣泛接受的技術(shù)，除成本因素外，還存在不少障礙。技術(shù)上的問題主要是細(xì)胞內(nèi)低豐度分子的檢測，缺少“通用”細(xì)胞通透物 質(zhì)，細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾效應(yīng)，熒光分子間發(fā)射光譜的重疊，以及缺少可識別目標(biāo)分子的試劑。特別是對于細(xì)胞分揀來說，由于液滴的形成收集、分揀細(xì)胞重分析或 培養(yǎng)前的稀釋，以及為獲得足夠數(shù)量的可用細(xì)胞需要的時(shí)間延誤的原因，還存在細(xì)胞存活問題。zui后，特別是在處理低豐度對象時(shí)，數(shù)據(jù)分析也是很棘手的。
有一篇關(guān)于 流式細(xì)胞儀理論的不錯的綜述，介紹了流式細(xì)胞儀的操作語言。此外，還有另一篇文章涵蓋了提供流式細(xì)胞儀所用特定試劑的 主要抗體供應(yīng)商。本文將聚焦于以下幾點(diǎn)：
1）硬件的選擇和注意事項(xiàng)
2）流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分選的實(shí)際問題
3）數(shù)據(jù)分析和軟件。這幾個話題包含的內(nèi)容不展開論述
希望讀者在著手開展表1列出的一些流式細(xì)胞儀應(yīng)用研究前，了解一些注意事項(xiàng)。
| 應(yīng)用 | 細(xì)胞表面 | 細(xì)胞內(nèi) | 分揀 |
| 免疫反應(yīng) | 是 | 是 | 是 |
| 細(xì)胞凋亡&壞死 | 是 | 是 | O |
| Cell therapy | 是 | 否 | 是 |
| 信號傳導(dǎo)/ 激酶活性 | 是 | 是 | 是 |
| 細(xì)胞周期分析 | O | 是 | 是 |
| 可溶性蛋白定量 | 是 | 否 | 否 |
| 細(xì)胞器分析 | O | 是 | 是 |
| 胚胎& 多能干細(xì)胞 | 是 | O | 是 |
| 基因組分析 | 是 | 是 | O |
| 細(xì)菌分析 | 是 | 是 | 是 |
| 環(huán)境微生物分析 | 是 | O | 是 |
| 微藻/浮游生物種群和群落 | 是 | O | 是 |
| 表達(dá)載體效率 | O | 是 | 是 |
| 受體藥理學(xué) | 是 | 是 | 是 |
| 細(xì)胞衰老 | 是 | 是 | 是 |
| Sperm physiology and sexing | 是 | 否 | 是 |
| 癌癥干細(xì)胞分析 | 是 | 是 | 是 |
| 病理學(xué) - 疾病鑒別 | 是 | 是 | O |
| 產(chǎn)前診斷 | 是 | 是 | O |
| 癌癥診斷 | 是 | 是 | O |
| 遺傳性疾病診斷 | 是 | 是 | 是 |
| 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞和前體 | 是 | O | O |
| 基因表達(dá) | 是 | 是 | 是 |
| 病毒感染 | 是 | 是 | 是 |
| 食品安全 | 是 | O | 否 |
| 突變 | O | 是 | 是 |
| 毒理學(xué)和誘變 | O | 是 | O |
| 染色體分揀 | O | 是 | 是 |
| HLA分型 | 是 | 否 | 否 |
| 異種移植監(jiān)測 | 是 | O | 是 |
| 細(xì)胞離子通量 | 是 | 是 | O |
| 高通量檢測 | 是 | 是 | O |
| 細(xì)胞克隆 | 是 | 否 | 是 |
| 細(xì)胞分裂和遷移(CFSE) | 是 | 是 | O |
表1. 流式細(xì)胞儀和/或細(xì)胞分揀的常見應(yīng)用
硬件
在決定需要什么實(shí)驗(yàn)設(shè)備的時(shí)候，細(xì)胞生物學(xué)家需要了解自己的預(yù)計(jì)需求和預(yù)算。表2列出了市場上可有的選擇。由于這些設(shè)備會不斷更新，建議到制造商查詢。
| 細(xì)胞分揀設(shè)備 | |
| JSAN® / Bay Biosciences® | Benchtop Asian Co. |
| BD® / FACS Calibur / Aria | Also clinical instruments |
| Beckman Coulter® / MoFlo® | Also clinical instruments |
| Cytonome® | Closed Cartridge |
| Influx / BD® | Large Particle |
| Micromet AG | Acquired by Amgen 3/12 |
| Owl / Innovative Micro Technologies | Microfluidic cartridges |
| Partec | Bench top |
| Sony® / iCyt | Start-Up |
| Union Biometrica® | Large Particle |
| 流式細(xì)胞儀（分析級） | |
| Accuri®/ BD® | Bench top to multi-laser |
| Attune / Life Technologies® | Acoustic focusing |
| Apogee | Small particle focus |
| Guava / Millipore® | Microcapillary |
| Gallios / Beckman Coulter® | Multi - laser |
| Stratedigm | Iso-Pressure Fluidics |
| 競爭技術(shù) | |
| Amnis | Imaging Cytometry |
| DVS Sciences®/CyTOF | Mass Spec discrimination |
| Miltenyi and others | Magnetic Beads |
表 2. 主要設(shè)備供應(yīng)商
做小顆粒分析的專業(yè)公司（JSAN, Partec, Accuri）將他們的服務(wù)定位于個體實(shí)驗(yàn)室或需對其細(xì)胞分揀儀做恒定質(zhì)量分析的實(shí)驗(yàn)室。他們通常會用到改進(jìn)的更小的激光二極管和微流體。但如果需要做每 日監(jiān)控或者對大型項(xiàng)目（如臨床試驗(yàn)）的多臺儀器的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，其軟件沒有大公司的強(qiáng)大。一個建議是確保儀器輸出文件能夠同您打算使用的收集后分析軟件兼 容。
研究人員對研究對象進(jìn)行了分類，超大型（浮游生物、母細(xì)胞、早期胚胎），非常小（微粒、細(xì)菌）或者高度不對稱（精子、肌小管）。確保您將要使用的儀器以前在這一應(yīng)用中被成功使用過。噴嘴直徑、流動細(xì)胞的幾何形狀、流速、液滴大小、檢測器位置都會影響到結(jié)果。
再生醫(yī)學(xué)和癌癥治療研究通常要求對細(xì)胞進(jìn)行分離以確保純度、細(xì)胞活力，并且便于在流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)室和病人間運(yùn)送。Closed cartridges (Owl，Cytonome公司) 似乎是制造商為解決這一問題的一個嘗試。另一個途徑是提供帶有無菌罩或者可匹配標(biāo)準(zhǔn)尺寸無菌罩的細(xì)胞分揀儀。
有幾種可增強(qiáng)流體流動的技術(shù)，如聲學(xué)對焦 (Life Technologies公司)、等壓射流 (Stratedigm公司)、毛細(xì)管(Millipore公司)，或微流控技術(shù)（幾個還在開發(fā)中）。它們大多已在其他設(shè)備上應(yīng)用，卻未必已用于流式細(xì)胞 儀。為便于使用者獲得及時(shí)反饋，我建議本文讀者加入 普渡大學(xué)流式細(xì)胞儀訂閱。許多流式細(xì)胞儀方面的人物都會定期在該論壇上提供有價(jià)值的信息。其他博客，比如Google+，也有類似功能，但它們?nèi)狈ζ斩蓤F(tuán)隊(duì)的深度和廣度。
另外，還有一些有意思的技術(shù)在這一領(lǐng)域也很有影響。首先，利用Miltenyi或其他公司的磁珠對目的細(xì)胞做預(yù)純化或清洗可提高分揀效率。當(dāng)然，僅僅利 用一輪或多輪磁珠篩選而不用流式細(xì)胞儀，許多研究也能開展起來，但這不是本文討論的重點(diǎn)。Amnis 公司已將流式細(xì)胞儀射流與熒光顯微鏡和數(shù)字成像整合在一起。其結(jié)果是一系列單個細(xì)胞的圖像能夠顯示熒光團(tuán)的分布，而非簡單的平均熒光指數(shù)（MFI）。 DVS Sciences已極大地?cái)U(kuò)展了可用質(zhì)譜（MS）檢測結(jié)合報(bào)告抗體的金屬螯合物的靶標(biāo)數(shù)。目前有33種不同的金屬可被同時(shí)檢測。該儀器被Time of Flight 稱為"Cytof" [1]?？紤]購買該儀器的研究人員應(yīng)該確保他們有這一深度的細(xì)胞分析需要。此外，細(xì)胞在等離子體中會被汽化，所以用于研究的細(xì)胞不能恢復(fù)。
細(xì)胞分揀儀制造商有一點(diǎn)不能達(dá)成共識，激光檢測是在細(xì)胞通過噴嘴后的液滴中（空氣中的蒸汽），還是液滴形成前的流動細(xì)胞內(nèi)，完成效果好。如圖1， （上圖）一個蒸汽系統(tǒng)（Influx，也可能是FACSCalibur或其他設(shè)備），（下圖）一個流動細(xì)胞系統(tǒng)（BD公司的 FACS Aria III）。
圖 1. 蒸汽的（頂部）和流動的（底部）細(xì)胞分揀裝置的光學(xué)構(gòu)造。BD Biosciences®轉(zhuǎn)載許可。
這兩者各有優(yōu)勢和局限。蒸汽分揀儀硬件設(shè)備簡單，檢測點(diǎn)與收集裝置間距離較短，檢測樣品的激光數(shù)多。而流動細(xì)胞分揀系統(tǒng)通過比色皿提供層流和增強(qiáng)的樣品 聚焦。然而，流動細(xì)胞長度有限，而且激光光學(xué)裝置需要足夠空間避免不同通道間的串?dāng)_。對于敏感性來說，流動細(xì)胞系統(tǒng)明顯占優(yōu)，但蒸汽系統(tǒng)沒有保持細(xì)胞清潔 的問題，并且能提供額外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身對細(xì)胞有毒害作用。
細(xì)胞懸浮于液滴中，然后使其經(jīng)主脈沖自由下滴（或提供壓力）。有關(guān)液滴如何帶點(diǎn)和偏向的問題，請參考Labome其他流式細(xì)胞儀的文章 圖7。
此外，關(guān)于培養(yǎng)基種類和細(xì)胞存活體積的問題。相關(guān)文章和普渡大學(xué)有大量關(guān)于培養(yǎng)基的建議，但培養(yǎng)基通常會選用牛胎兒血清（FBS）。將細(xì)胞收集到 11 x 75 毫米或更大的管中，需要用到0.5 - 1 mL的牛胎兒血清。對于多層平板來說，牛胎兒血清應(yīng)該占一半的體積，因?yàn)檫€要考慮平板干掉的問題。而如果僅僅是收集核酸，用于細(xì)胞裂解和核酸提取的同樣的 產(chǎn)品就可以了。此外還建議對進(jìn)一步處理的細(xì)胞在營養(yǎng)豐富的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇。
所有的流式細(xì)胞儀制造商都在增加分揀細(xì)胞存活方面取得了很大的進(jìn)步。微流體方面的新進(jìn)展可能使不通過液滴形成做細(xì)胞收集成為現(xiàn)實(shí)。不管答案是否是毛細(xì)管-基礎(chǔ)系統(tǒng)或基于微通道的系統(tǒng)，都必將規(guī)避分揀時(shí)的細(xì)胞壓力問題。
試劑-抗體
除非你用病人血清建立診斷檢測，不缺少提供流式細(xì)胞儀抗體的公司。請見Labome文章 列表。然而，并非所有這些公司都有相同克隆-并且不是所有克隆在流式細(xì)胞分析中作用方式相同。如果文章中沒有列出想要的克隆，而你又想運(yùn)行相似的實(shí)驗(yàn)，請作者找出使用的哪一克隆。
多數(shù)公司不會公開抗體純化和標(biāo)記的方法，但如果你是從一個聲譽(yù)較好的公司購買，同一克隆標(biāo)記相同的熒光基團(tuán)就可以了，除非是在發(fā)貨途中受損，微生物污染或者保存不當(dāng)。按照制造商建議的儲存條件，抗體至少能保質(zhì)一年。
然后，你應(yīng)該決定你的實(shí)驗(yàn)是否要用熒光直接標(biāo)記的抗體，或者用二抗，生物素-鏈霉親和素，或其他配體-受體。除非您的實(shí)驗(yàn)室預(yù)算緊張，應(yīng)使用直接標(biāo)記的抗體。直接標(biāo)記的抗體背景較低，沒有裂解細(xì)胞釋放的生物素造成干擾，重復(fù)性較好。
另一種選擇是用標(biāo)記試劑盒或者第三基團(tuán)標(biāo)記的抗體，如 SoluLink或其他的。一些抗體制造商也提供用戶定制標(biāo)記，但應(yīng)認(rèn)真考慮公司在抗體標(biāo)記方面的聲譽(yù)如何。所有的化學(xué)基團(tuán)各有優(yōu)劣，因此需要慎重考慮交聯(lián)劑（請見Thermo Fisher Pierce 實(shí)用指南。
有五種基本類型的熒光染料：小分子染料（如熒光異硫氰酸酯/ FITC和Alexa染料），蛋白染料（藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、綠色熒光蛋白），串聯(lián)染料，其中蛋白染料收集熒光，將它傳輸至小分子染料，然后串聯(lián)染料發(fā) 出同小分子染料（如APC-Cy7）量子點(diǎn)和多聚染料( 亮紫)相同波長的光波。所有的都各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，但蛋白染料和小分子染料在流式細(xì)胞儀中使用時(shí)間zui長。
我們很容易就能觀察到標(biāo)記的大分子蛋白（> 100 kD）、疏水性染料或聚合物是如何改變單克隆抗體活性的。為說明相對相對大小，圖2顯示了一個抗體分子與一個蛋白分子共軛的結(jié)構(gòu)（在這種情況下辣根過氧化 物酶“只有”44 kD）。我們可以得出這樣的結(jié)論：zui安全的方法是使用以前別人用過的同一克隆抗體和熒光染料結(jié)合的抗體。但是，我們?yōu)槭裁床荒軇?chuàng)造出一種*的抗體呢-通 過表達(dá)細(xì)胞或非表達(dá)細(xì)胞共軛組合并表征其特異性，然后滴定抗體zui大化其信噪比，這樣你的實(shí)驗(yàn)室就有一個新的試劑了。
圖 2.
試驗(yàn)中選擇熒光染料基于以下幾點(diǎn)：
1）流式細(xì)胞儀或細(xì)胞分揀儀上可以用什么樣的激光器和濾波器
2）目標(biāo)相對豐度-更亮的熒光染料應(yīng)該用在低豐度的分子上
3）靶標(biāo)是否在細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)靶標(biāo)被包埋于細(xì)胞中，所以應(yīng)該使用zui亮的熒光染料兩種激光儀器，比如Guava? EasyCyte 或者BD? FACSCalibur 只能使用四種熒光染料，所以染料選擇就像設(shè)置一個可用熒光染料基質(zhì)并設(shè)其為檢測目標(biāo)一樣簡單。PE通常是zui亮的，其次是APC，因此它們應(yīng)該被連接到胞內(nèi) 或低豐度的抗體上。想了解發(fā)射光溢出量，例如PE通道中的異硫氰酸熒光素，我們可以參考光譜分析 Invitrogen公司或者 BD公司。
如果超過兩種激光/四種顏色，我們就必須考慮自動還是手動補(bǔ)償了。 [2] [3] Fluorescence minus One (FMO)可以控制 [4] 分析儀器-特定波長、強(qiáng)弱和熒光染料的重組。對于這些問題，我建議閱讀相關(guān)文獻(xiàn)并咨詢您的流式核心管理層和內(nèi)部專家。
試劑 - 固定劑和通透緩沖液
使用的固定劑幾乎都是多聚甲醛、PFA或者甲醛。這三種名字的固定劑都會用到，但其活性成分是相同的。固定劑應(yīng)在磷酸鹽緩沖液（PBS）中稀釋至1-4%，固定過程通常在冰上進(jìn)行。如果是激酶或磷酸蛋白，其磷酸酶需要迅速失活，因此PFA通常在37℃下使用。
甲醛可與伯胺作用，因?yàn)榭贵w含有結(jié)合位點(diǎn)通常帶有靜電相互作用，賴氨酸固定修飾可避免抗體與固定蛋白結(jié)合。這也是為什么根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)方案可以節(jié)省時(shí)間和 試劑的原因。顯然，固定（包括通透）會迅速殺死細(xì)胞，因此如果下一實(shí)驗(yàn)步驟是細(xì)胞分級分離或核酸提取，通常會先對固定細(xì)胞進(jìn)行分揀操作。
根據(jù)目標(biāo)抗體是否分泌并在高爾基體內(nèi)滯留，激酶或磷酸化蛋白是否需要磷酸酶抑制劑，核蛋白是否需要磷脂雙分子層部分溶解和DNA松弛，細(xì)胞透化需要選擇不同的方式。所有這些方法都會用到去污劑或酒精，去污劑zui溫和，而酒精特別是甲醇zui強(qiáng)效。
當(dāng)目標(biāo)在胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，首先需要用到zui溫和的去污劑皂素。低濃度，通常0.1%的皂素，對胞內(nèi)細(xì)胞因子著色就足夠了 [5]。一些非離子去污劑，如Triton X-100、吐溫80也有使用，但皂素是zui常見的選擇。
對于激酶和磷酸化蛋白來說，相關(guān)技術(shù)來自斯坦福大學(xué)的Gary Nolan 實(shí)驗(yàn)室 [6] [7]。磷酸酶被PFA和預(yù)冷酒精滅活，酒精也可以作為二次固定和強(qiáng)效通透的試劑。文章中建議70%-100%濃度的酒精，而70%和90%濃度的酒精zui常見。也有通透前先染色的例子。在去污劑和酒精中滴定抗體的-基于協(xié)議，可以在 Cytobank找到。分析深度的例子請見圖3。
圖 3. 典型的Cytobank數(shù)據(jù)庫熱圖
用甲醇或乙醇作為透化劑可以作用核內(nèi)目標(biāo)。乙醇對于擴(kuò)增細(xì)胞-特異性作用于Ki-67更好一些 [8]，但甲醇用的更多。并非所有抗體都結(jié)合PFA-甲醇固定細(xì)胞，因此許多單抗供貨商會提供一個相容性的表。然而，如果熒光劑是蛋白，在細(xì)胞用抗體染色前必須確保甲醇已經(jīng)去除干凈，因?yàn)楹芏嗟鞍讓Υ碱惖拿撍饔帽容^敏感。
醇類脫水作用的另一個受害者是那些細(xì)胞內(nèi)表達(dá)用于流式細(xì)胞分析的熒光蛋白。它們包括綠色熒光蛋白、mCherry和Cerulean3。如果熒光信號被醇類處理破壞，就需要用到熒光蛋白抗體來檢測變性熒光蛋白了。
試劑-染料
非結(jié)合染料在 早年是 *種用于流式細(xì)胞分析的細(xì)胞染色試劑。下面介紹的用到的染料可以分成活體染料（vital dyes）、核酸插入染料（nucleic acid intercalating dyes）、譜系染料（lineage dyes）、陽離子和pH通道染料（cation and pH flux dyes）、外排染料（efflux dyes）和細(xì)胞器染料（organelle dyes）。只有zui常用的或者用到的染料才會被提及，如果想查看其他的來源，請參見 分子探針。備注：分子探針? 有15種染料。
活體染料
臺盼藍(lán)（Trypan Blue）是*種被發(fā)現(xiàn)不能進(jìn)入活細(xì)胞而能自由進(jìn)入死細(xì)胞的染料。PubMed上有一篇參考文獻(xiàn)提及它的使用可以追溯到1914年，*篇用于流式細(xì)胞 分析的文獻(xiàn)可以在上面Beckman Coulter鏈接中找到。而zui早將臺盼藍(lán)作為活體染料的文章可以追溯到1980年 [8]。從那以后，碘化丙啶（PI）和7-氨基放線菌素D（7-AAD）也被作為了活體染料的選擇 [9]。7-AAD在流式細(xì)胞分析中往往較少會外溢到臨近的通道中，因此明亮的DNA染料和另一種柔和的并且有重疊發(fā)射光譜的熒光分子一起使用的時(shí)候，一定要多加小心。
核酸插入染料
溴化乙錠(EtBr) 和碘化丙啶（PI）能夠結(jié)合到DNA雙螺旋的大溝。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和Hoechst染料（有幾種常用的）則結(jié)合小溝。請注意， 一些染料 (例如碘化丙啶)也會結(jié)合到RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成的溝中，因此如果要做DNA定量，需要用染料和RNA的混合液。其它染料，如7-AAD，不會與DNA大小 溝結(jié)合。
DNA 染料也用于細(xì)胞周期分析、染色體倍數(shù)分析和基因組大小量化。對于這些研究，通常會用到上面提到的DNA染料，但數(shù)據(jù)分析要求非?？量?。幸運(yùn)的是，有一篇很好的文章詳細(xì)概述了這一過程 [10]。
細(xì)胞凋亡測定就用到了流式細(xì)胞儀的多個特性。與DNA結(jié)合而不透細(xì)胞膜的染料可用于鑒定晚期凋亡和壞死細(xì)胞。識別細(xì)胞周期蛋白（聚合酶的裂解結(jié)構(gòu)和磷酸化 組蛋白H3）的抗體都可以購買到。zui早的細(xì)胞凋亡標(biāo)記是磷脂酰絲氨酸（PS）溢出，它通常只在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)膜上存在。溢出被檢測到，卻并非用的抗體，而是通 過一個Ca2+依賴的結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）。這一分子可以購買到，通常連接幾種不同的熒光劑，它已經(jīng)成為研究細(xì)胞凋亡的支柱。膜聯(lián)蛋白V的詳細(xì)分析請參見 [10]。
譜系染料，例如羧基二醋酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）利用膜滲透結(jié)合蛋白，然后通過琥珀酰亞胺酯與鄰近蛋白作用。一旦被染色，細(xì)胞經(jīng)過幾次分裂后仍然是染色狀態(tài)，因?yàn)楦?xì)胞分裂消耗的時(shí)間相比，蛋白質(zhì)的更新更緩慢。
陽離子和pH通道染料
鈣離子(Ca2+)用Fura-2和Indo-1染料檢測 [12]， 它們需要紫外線激發(fā)，因此許多流式細(xì)胞分析常用的染料在它們身上卻不能使用。Magnesium Green和 一些Fura-衍生物已經(jīng)被成功用到檢測Mg2+上 [13]。其中有些是在可見光譜中激發(fā)的。對pH值測定的熒光染料從1979年就開始使用了。要收集實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，您的流式細(xì)胞儀要能顯示帶有時(shí)間軸的數(shù)據(jù)，收集率也必須在您想要測定的時(shí)候可以兼容多個樣品。
外排染料
幾種正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠運(yùn)輸有機(jī)化合物到細(xì)胞外。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，這是極其重要的，從細(xì)胞中移除的分子可以作為化療藥物。然而，該轉(zhuǎn)運(yùn)過程在正常細(xì)胞 中也能被發(fā)現(xiàn)，包括干細(xì)胞。一些外排的分子還具有熒光活性，有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的細(xì)胞外觀不同，當(dāng)這些染料存在的時(shí)候，可通過流式細(xì)胞術(shù)分離。zui常用的染料是 Hoechst 33342，有轉(zhuǎn)運(yùn)活性的細(xì)胞被稱為“側(cè)群細(xì)胞”[14]。
細(xì)胞器染料
標(biāo)記細(xì)胞器的方法有三種。首先，可以用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該載體上攜帶熒光蛋白基因，以及將蛋白質(zhì)同特定細(xì)胞器分離的足夠肽段信息。第二，有結(jié)合細(xì)胞器的 抗體 - 特異性標(biāo)志物，但它們需要細(xì)胞有通透性。染料往往使用簡單，穩(wěn)定，熒光比多數(shù)熒光蛋白更明亮，一些可用于活細(xì)胞。Molecular Probes?提供多種染料，包括產(chǎn)品明細(xì)一個有用 。 一些常用的染料有：用于線粒體的紅色或綠色MitoTracker；用于氧化狀態(tài)線粒體的Dihydrorhodamine 123；LysoTracker Green和Lysosensor Green；用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的DIOC染料，以及作用于高爾基的BODIPY染料。
數(shù)據(jù)分析-軟件
軟件使得圍繞數(shù)據(jù)分析的問題變得稍稍簡單了，這也是本文這一部分要討論的主題。然而，大多數(shù)軟件以硬件的方式來匹配特定儀器的操作和數(shù)據(jù)分析。在眾 多廠商里，根據(jù)收集的信息是模擬的還是數(shù)字的，數(shù)據(jù)有很大的差異。慶幸的是，有一些不錯的第三方軟件程序包，有一個甚至是免費(fèi)的，并且他們幾乎不受儀器限 制，能夠開展多數(shù)想要的數(shù)據(jù)分析。
即使考慮到以上所列的困難，我們?nèi)匀徊荒軐⒂眠@些儀器收集到的信息的廣度和深度細(xì)化為生物學(xué)或醫(yī)學(xué)的重要性的問題。在( PubMed)搜索"flow cytometry" OR "FACS"的綜述文獻(xiàn)能找到許多這一話題的文章，其中這兩種方法中的一種或者兩種都有所使用。表I為通過這種方式找到的應(yīng)用列表。
應(yīng)使用流式細(xì)胞儀或細(xì)胞分揀儀自帶的軟件控制儀器，除非有令人信服的理由不要使用第三方軟件。通常這涉及到購買儀器制造商不再支持的用過的儀器。多數(shù)機(jī)器 特定的軟件允許進(jìn)行一些分析。一臺雙激光臺式儀器可能沒有邊緣切割補(bǔ)償、標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)軟件包。其次，有些軟件可能有大多數(shù)功能，但缺乏一個你需要的手稿或 演示文稿。第三，可能你的合作者有一臺不同的儀器，但你需要與他共享數(shù)據(jù)。zui后，你可能有數(shù)量有限的儀器軟件副本，但也有許多用戶想在他們自己的電腦上處 理數(shù)據(jù)，而不破壞原始數(shù)據(jù)。表III是主要的軟件套裝和它們應(yīng)用的儀器。
首先，需要考慮儀器的類型。較舊的儀器，如BD FACS Calibur和FACScan，將數(shù)據(jù)處理為模擬信息。較新的儀器，如目前市場上大部分儀器，將數(shù)據(jù)處理為數(shù)字信息。模擬儀器輸出是一個FCS 2.x文件，它幾乎可以被任何分析軟件包讀取。數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)可以導(dǎo)出為FCS 2.x或3.x文件，一些較舊的分析程序不能解析FCS3.0數(shù)據(jù)。一個例子是一個由Joe Trotter編寫的免費(fèi)軟件包，可從 WinMDI下載。它可以在Windows 95和NT上運(yùn)行，網(wǎng)上也有討論它可能可在XP上運(yùn)行。也有一個為老式Macintosh計(jì)算機(jī)上運(yùn)行SoftWindows編寫的In 80286版本。
不幸的是，即使兩臺儀器生成同樣的FCS 3.0數(shù)據(jù)，卻并不意味著人們可以自由地分享不同制造商儀器之間的數(shù)據(jù)。通常情況是文本格式的問題，可能有一些網(wǎng)上資源可以將一臺儀器特定格式的文件轉(zhuǎn)換 成另一臺儀器的。三個儀器獨(dú)立包可以自動或有小的應(yīng)用程序?yàn)橛脩暨@么做。
數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)的優(yōu)勢是什么？zui重要的是，每個數(shù)據(jù)點(diǎn)（細(xì)胞）包含相關(guān)數(shù)據(jù)，這樣，如果您將數(shù)據(jù)加載到分析軟件包，包括補(bǔ)償在內(nèi)的幾乎所有參數(shù)可以修改。 FCS 2.x數(shù)據(jù)不能恢復(fù)為預(yù)補(bǔ)償條件，重新分析就受到限制了。
當(dāng)然也有軟件包可以填補(bǔ)現(xiàn)有的分析或演示選項(xiàng)的缺口。其中有兩個例子，BD Biosciences的CytoPaint ( Leukobyte)和 Paint-A-Gate ，允許進(jìn)行批處理聚類分析和展示/ 另一個則是 Phoenix Flow Systems它在擴(kuò)增和DNA分析的時(shí)候非常有用。
| 公司 | 軟件 |
| 通用儀器 | |
| Cytobank | Cytobank |
| DeNovo Software | FCS Express |
| TreeStar | FlowJo |
| *儀器 | |
| Cell Sorters | |
| JSAN® / Bay Biosciences® | AppSan |
| BD® / FACS Calibur/Aria | Cellquest / DIVA |
| Beckman Coulter® / MoFlo® | Kaluza / Summit |
| Cytonome® | GigaSort |
| Influx / BD® | Spigot / BD FACS Software |
| Owl / Innovative Micro Technologies | To be determined |
| Partec | FloMax / CyFlow |
| Sony® / iCyt | WinList 3-D |
| Union Biometrica® | COPAS / BioSorter ? VAST |
| Flow Cytometers (analytical) | |
| Accuri®/ BD® | Cflow / BD C6 Software |
| Attune® / Life Technologies® | Attune® Software |
| Apogee | Apogee A-40 Software |
| Guava / Millipore® | GuavaSuite / InCyte |
| Gallios / Beckman Coulter® | Kaluza |
| Stratedigm | CellCap |
| Competing Technologies | |
| Amnis / Millipore | IDEAS |
| DVS Sciences®/CyTOF | 數(shù)據(jù)處理軟件 |
表3?，F(xiàn)有的流式細(xì)胞儀軟件
目前，用于分析和數(shù)據(jù)共享好用的免費(fèi)軟件包是Cytobank，上面展示了它的細(xì)胞分揀（FACSelect）功能。對那些打算研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子運(yùn)行細(xì) 胞內(nèi)流式分析的研究者來說，Cytobank能夠與他們進(jìn)行數(shù)據(jù)共享，F(xiàn)ACSelect就是其中一個例子。上傳的數(shù)據(jù)是保密的，可以將其標(biāo)記為公開，或 只與特定的合作者共享。這樣，數(shù)據(jù)可以是限制的，*不受限制的，或限制只向同行開放。Cytobank集成了所有*工具：補(bǔ)償、限群、設(shè)置層次結(jié)構(gòu)、 顯示事件子集表、創(chuàng)建等值線圖和熱圖、疊加直方圖。圖4是Cytobank數(shù)據(jù)的熱圖。
Cytobank確實(shí)提供了一個基于訂閱的高維數(shù)據(jù)集的功能。該軟件被稱為 "SPADE"。
圖 4. 典型的批量分析堆疊直方圖
FlowJo是目前zui常用的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析軟件包。程序安裝在個人電腦上，TreeStar可以跟隨目前數(shù)據(jù)分析和演示的趨勢。 FlowJo site提供了一個30天的試用版本10（蘋果版是9.6）。這本手冊有一個令人印象深刻的新功能列 表。不用說，建議在購買前先試用一下。圖5是批處理分析產(chǎn)生一系列層疊直方圖。流式細(xì)胞儀會快速生成大量數(shù)據(jù)。分析大量批處理樣品，然后以一種有意義的方式將它們展示出來是任何流式細(xì)胞分析軟件包的*能力。
圖 5. DeNovo軟件得出的流式細(xì)胞分析結(jié)果
還有一個不錯的選項(xiàng)是DeNovo 軟件的FCS Express在線數(shù)據(jù)包。一位代表堆疊柱狀圖產(chǎn)生的一個批次analysisThe的替代方案，也是一個非常不錯的選擇，是在網(wǎng)上包FCS快速從頭軟 件。它也有一個令人印象深刻的功能列表，并且還產(chǎn)生了出版物 - Ready圖形。圖6示出了此分析軟件包的功率，并獲得的數(shù)據(jù)時(shí)，在接近瞬時(shí)的鈣的細(xì)胞內(nèi)的波動。請注意，X軸是時(shí)間和更迅速的細(xì)胞訊問，更有意義的數(shù) 據(jù)。它也有一個令人印象深刻的新功能列 表，也生成直接用于發(fā)表的圖形。圖6展示了此分析軟件包的強(qiáng)大，對幾乎瞬時(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣波動獲得的數(shù)據(jù)。請注意，X軸是時(shí)間，細(xì)胞檢測的越快，數(shù)據(jù)越有意義。
請注意，F(xiàn)CS Express已經(jīng)適應(yīng)了它們的圖像分析軟件，這一類型數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，因此如果一個人要從儀器上生成數(shù)據(jù)，必須留心，需匹配軟件的數(shù)據(jù)類型。
FCS從頭分析軟件
總結(jié)軟件部分，流式細(xì)胞儀會產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)。 導(dǎo)出的FCS標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)能夠直接與不同儀器中的結(jié)果進(jìn)行整合。儀器特異性的和儀器通用的分析軟件包給新用戶的是安全感的假象。要生成大量的數(shù)據(jù)并不難，但如 果我要試圖解釋這些數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)的、收集的和分析的變量卻是無窮的。要學(xué)習(xí)如何選擇正確的試劑，適當(dāng)?shù)奶幚砑?xì)胞，設(shè)置儀器優(yōu)化您的應(yīng)用程序，補(bǔ)償和運(yùn)行恰 當(dāng)?shù)目刂?，闡明數(shù)據(jù)的意義，這些技能的獲得都需要耗費(fèi)時(shí)間。除非你不打算運(yùn)行四個以上的熒光染料并且所有的染色都是在細(xì)胞表面，跟有經(jīng)驗(yàn)的使用者緊 密合作，能避免所有自學(xué)者犯的常見錯誤。如果你打算做細(xì)胞分揀并希望zui后保留活細(xì)胞，這些是尤為重要的。
總結(jié)
請看表I列出的30多種流式細(xì)胞的應(yīng)用。找出zui接近您的研究興趣的一個，然后在PubMed 或谷歌學(xué)術(shù)上做快速的文獻(xiàn)檢索。確保"cytometry"為關(guān)鍵詞。留心在zui近的幾篇文章中數(shù)據(jù)的展示方式，了解試劑的數(shù)量，所用儀器的復(fù)雜性，以及數(shù) 據(jù)是如何被呈現(xiàn)出來的。然后回到本文中，看看我界定的新用戶和有經(jīng)驗(yàn)的用戶可能會面臨的所有潛在風(fēng)險(xiǎn)。對流式細(xì)胞儀的分析時(shí)間，試劑（和同種型對照，補(bǔ)償 珠，以及其他試劑和緩沖液）的成本做出估計(jì)。然后根據(jù)您的特定需要對其進(jìn)行修訂，安排少數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的使用者運(yùn)行程序。這是我希望給那些剛進(jìn)入該領(lǐng)域或者將要 開展從簡單分析到復(fù)雜多色實(shí)驗(yàn)的使用者推薦的zui低限度的準(zhǔn)備。
參考文獻(xiàn)
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